analyses microbiologiques

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On trouvera au chapitre Organismes aquatiques une description globale du règne bactérien et une méthode d’identification des principaux micro-organismes aquatiques. On ne s’intéressera ici qu’au contrôle sanitaire des eaux.

principe du contrôle sanitaire

L’eau destinée à la consommation humaine ne doit pas nuire à la santé des consommateurs, elle doit donc être exempte de tout micro-organisme pathogène.

Rechercher l’ensemble des germes pathogènes (bactéries, virus, parasites) est impossible et serait beau­coup trop onéreux ; les espèces sont nombreuses (Salmonella, Shigella, Campylobacter, Vibrio cholerae, Leptospir, Giardia, Cryptosporidium, Rotavirus, virus de la poliomyélite, virus de l’hépatite A…) – leur recherche est souvent complexe et laborieuse, certaines ne sont réalisables que par des laboratoires haute­ment spécialisés – leur présence est irrégulière et aléatoire.

Les micro-organismes pathogènes véhiculés par l’eau étant pour la plupart d’habitat fécal, il a donc été suggéré de retenir comme principe de contrôle « la recherche de certaines espèces ou groupe de bactéries, comme témoins indicateurs de contamination ou pollution fécale ». Ces germes tests sont des bactéries commensales qui sont naturellement présentes dans les intestins des hommes et des animaux à sang chaud, et excrétées régulièrement en abondance dans les matières fécales.

Les normes de potabilité d’une eau posent donc comme hypothèse que les lois d’élimination des germes pathogènes et des germes tests sont comparables et qu’à un abattement important de germes tests corres­pond une élimination poussée des germes pathogènes. La présence des indicateurs constitue donc un signal d’alarme et laisse présager la possibilité d’une présence de pathogènes. De même, leur absence sup­pose l’absence de pathogènes.

La réglementation a retenu comme germes indicateurs de contamination fécale les bactéries entéroco­ques et coliformes thermotolérants aujourd’hui supplantés par l’espèce Escherichia coli.

À ces germes tests se rajoutent :

  • la recherche d’indicateurs d’efficacité de traitement : spores de bactéries anaérobies sulfitoréductrices (décret français) ou spores de Clostridium perfringens (directive européenne) ;
  • les dénombrements des germes aérobies revivifiables à 22 °C et à 36 °C dits germes banals sont utilisés à titre de surveillance pour la distribution de l’eau. Leurs valeurs n’ont qu’une importance secondaire, ce sont leurs variations, et notamment une augmentation brusque, qui peuvent être le signe d’une altération de la qualité de l’eau au cours de la distribution.

les analyses bactériologiques

Les laboratoires disposent de méthodes normalisées pour répondre au besoin du contrôle sanitaire.

Le dénombrement des germes totaux s’effectue par incorporation d’un faible volume d’échantillon en milieu solide nutritif.

Pour les germes indicateurs, les méthodes les plus usitées sont les méthodes par filtration sur membrane puis dépôt de celle-ci sur un milieu de culture gélosé spécifique ou adapté à la bactérie recherchée. Le milieu est incubé selon des conditions optimales de croissance, en termes de température et de temps.

Après incubation, chaque bactérie présente dans l’échantillon donnera naissance à une colonie visible à l’œil nu. Des tests de confirmation souvent basés sur des caractères biochimiques sont effectués sur les colonies présumées caractéristiques de l’espèce recherchée.

  • Les résultats sont obtenus en quelques jours. Ils s’expriment généralement en UFC (unité formant colo­nie).
  • Les conditions du prélèvement (stérilité, transport) sont excessivement importantes et conditionnent la validité du résultat (voir les prélèvements).

Dans le cas d’un examen plus complet, le laboratoire peut être amené à rechercher des bactéries patho­gènes pour l’homme comme Salmonella, Shigella, Legionella, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeru­ginosa…

les analyses virologiques

La méthode la plus utilisée consiste à dénombrer les entérovirus.

Une concentration préliminaire est indispensable. Les techniques les plus employées sont la filtration ou l’ultrafiltration sur membranes, les méthodes d’adsorption-élution sur différents supports (nitrate de cellu­lose, cartouche en microfibre de verre, poudre de verre), les méthodes de floculation organique.

La plupart des virus habituellement recherchés dans le milieu hydrique peuvent être isolés sur différents systèmes cellulaires. Les plus utilisés sont les cellules de lignée continue de rein de singe type BGM (buffalo green monkey), ou des cellules néoplastiques humaines (cellules Hela). La probabilité d’isoler un virus aug­mente avec le nombre de systèmes cellulaires utilisés. Il est ainsi recommandé d’employer au moins deux systèmes différents.

Les prélèvements concentrés sont inoculés aux cultures in vitro, et l’apparition d’un effet cytopathogène, révélé par observation microscopique, témoigne d’une multiplication virale et signe la présence de virus dans l’inoculum. Le nombre de particules virales infectieuses est alors exprimé soit en NPP (nombre le plus probable) pour les techniques de culture cellulaire en milieu liquide, soit en UFP (unité formant plages) pour les techniques de culture cellulaire en milieu solide. Les rendements de récupération sont généralement fai­bles. Les résultats sont obtenus en 2 à 3 semaines minimum.

les analyses parasitologiques

De nombreux parasites peuvent être véhiculés par les eaux usées.

Les plus recherchés dans les eaux sont deux protozoaires, Giardialamblia et Cryptosporidium parvum qui ont été responsables ces dernières décennies d’épidémies d’origine hydrique incontestable. Leur recherche est donc utile et souvent nécessaire, en particulier pour les eaux souterraines influencées par les eaux de surface.

La méthode est normalisée. Elle est commune pour la détection des kystes de Giardia et de Cryptospori­dium et comprend plusieurs phases :

  • concentration d’un grand volume d’eau par filtration sur cartouche en polyéther sulfone puis élution par agitation mécanique en présence d’une solution détergente ;
  • reconcentration par centrifugation puis extraction des kystes par immuno-séparation magnétique (IMS) ;
  • marquage par immunofluorescence (Anticorps monoclonaux marqués par un fluorochrome : l’isothio­cyanate de fluoresceïne (FITC), capables de se fixer spécifiquement sur les antigènes de surface des kys­tes) et coloration des acides nucléiques par DAPI (4’,6-diamino-2-phényl-indole) ;
  • l’observation microscopique à la longueur d’onde d’excitation de 490 nm révèlent les kystes colorés en vert pomme fluorescent.

Les résultats peuvent être obtenus dans la journée.

Cette méthode cible uniquement la forme enkystée du parasite et non la forme végétative infectieuse. Pour évaluer la viabilité ou l’infectivité des kystes, les tests existants (coloration spécifique, technique d’excystation, infectivité sur souriceaux) sont peu adaptés aux échantillons de l’environnement car leur seuil de sensibilité est souvent trop élevé.

les techniques de biologie moléculaire

Appliquées au contrôle sanitaire de l’eau potable, les techniques de détection moléculaire devraient cons­tituer une révolution dans le domaine de l’analyse et permettre d’assurer une surveillance plus complète et plus réactive de la qualité microbiologique de l’eau. Seules quelques applications existent à ce jour mais de nombreux programmes de recherche et développement sont en cours.

Contrairement aux méthodes traditionnelles d’identification qui étudient les caractères morphologiques et physiologiques des micro-organismes, l’identification moléculaire repose sur la reconnaissance d’une ou plusieurs séquences nucléiques, contenues dans la molécule d’ADN (ou d’ARN ) présentes dans tout micro- organisme vivant (bactéries, parasites, virus…). Les principaux avantages des outils sont leur rapidité, leurs hauts niveaux de spécificité et de sensibilité, ainsi que leur aptitude à l’automatisation. Ce sont des outils universels applicables à l’analyse de tous micro-organismes même ceux que l’on ne sait pas identifier par les méthodes traditionnelles.

Parmi les différentes techniques moléculaires, la technique PCR (Polymerase Chain Reaction) constitue l’un des outils de diagnostic les plus prometteurs. Cette étape d’amplification génique consiste à multiplier près d’un million de fois l’ADN cible du micro-organisme recherché, il n’est donc plus besoin de cultiver les bactéries sur boîtes de pétri ou d’isoler les virus par culture cellulaire. Pour mettre en évidence la viabilité des micro-organismes et s’assurer qu’ils ne sont pas « morts », les chercheurs utilisent la technique de RT- PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) qui cible les molécules d’ARN ( ARN messager, ARN ribosomique) dont la présence témoigne d’une activité métabolique des cellules.

La principale difficulté réside dans le fait que les micro-organismes pathogènes ou les indicateurs de con­tamination fécale que l’on recherche, sont présents en faibles proportions (quand ils le sont !) au milieu d’une flore « autochtone » souvent abondante. Les conditions opératoires doivent donc être optimisées pour s’affranchir des interférences potentielles et éliminer tout risque de faux négatifs.

algologie

Le dénombrement des algues peut se faire par examen en microscopie optique ou électronique. Les espè­ces sont différenciées par la nature des pigments qu’elles synthétisent, leur morphologie ou leur mode de reproduction (voir micro-organismes dont l'eau douce est l'habitat naturel).

Les échantillons sont généralement fixés par addition de formol (3 à 5 mL de solution à 40 % de formal­déhyde pour 100 mL d’échantillon). Si l’eau est pauvre en algues, il faut procéder à une concentration. Celle-ci peut être réalisée par centrifugation (5 000 t · min–1), par sédimentation (1 semaine dans une éprouvette de 1 L), ou par filtration sur sable fin ou sur membrane. Un comptage optique est ensuite effectué. Les résul­tats sont exprimés en nombre d’organismes ou de cellules, parfois en unités planimétriques standard (1 ups = 400 μm2) par mL ou par L d’eau.

On peut également évaluer la charge globale en algues d’une eau par le dosage des pigments chlorophyl­liens, notamment les chlorophylles a et b, après concentration sur membrane et extraction par l’acétone ou le méthanol.

pour aller plus loin :